實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1. 材料與試劑：新鮮小鼠脾臟、PBS緩沖液、無(wú)菌手術(shù)器械（剪刀、鑷子等）、細(xì)胞過(guò)濾器、CD4/CD8磁珠分選試劑（如需純化特定亞型），或陰選的方式去除B細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞的磁珠分選試劑，RPMI-1640培養(yǎng)基，人白介素2，胎牛血清，抗生素（如青霉素-鏈霉素）。
2. 設(shè)備：無(wú)菌操作臺(tái)、離心機(jī)、磁力分選架。

從小鼠脾臟獲取單細(xì)胞懸液

1. 小鼠頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡5分鐘，取出小鼠置于無(wú)菌操作臺(tái)上，左腹側(cè)朝上。
2. 在小鼠左腹側(cè)中部剪開小口，撕開皮膚暴露腹壁，可見紅色長(zhǎng)條狀脾臟。
3. 在脾臟下側(cè)提起腹膜，剪開后上翻，暴露脾臟，用鑷子提起脾臟，眼科剪分離下面的結(jié)締組織，取出脾臟，剝?nèi)ブ車慕Y(jié)締組織，期間用含有2%FBS的PBS溶液保持脾臟濕潤(rùn)。
4. 將脾臟放于70UM過(guò)濾網(wǎng)中，用注射器針芯輕輕研壓脾臟，用含2%FBS的PBS沖洗過(guò)濾網(wǎng)，獲細(xì)胞懸液。
5. 300G離心5分鐘，收集細(xì)胞沉淀，然后加入紅細(xì)胞裂解液裂解，將紅細(xì)胞充分裂解，收集白細(xì)胞。

從單細(xì)胞懸液中分離小鼠原代T細(xì)胞

1. 全T細(xì)胞分離：利用陰選的方式去除B細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞等，按照分選試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。
2. 亞群分離（如需要CD4+或CD8+ T細(xì)胞）：
• 使用CD4或CD8磁珠（如MACS磁珠）分選獲得特定T細(xì)胞亞群。
• 將磁珠標(biāo)記的細(xì)胞懸液置于磁性分選裝置中，分離出目標(biāo)T細(xì)胞亞群。

培養(yǎng)與檢測(cè)

1. 將分離的T細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并加入抗生素與人白介素2。
2. 細(xì)胞密度一般控制在1-2×10^6 CELLS/ML，放入37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染

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